细谈内毒素对免疫细胞功能学评价方法的影响

NF-kB信号通路

      NF-κB转录因子在1986年首次报道时，发现其是一种能够结合免疫球蛋白kappa轻链基因增强子元件的核因子蛋白，并能够激活B细胞，也是其名字的由来（nuclear factor，kappa light-chain，B cells）。随后的研究发现NF-κB转录因子能够在几乎所有类型细胞里结合特定的DNA位点，达到调控目的基因和各式生理功能的作用。随着研究的深入不断地有和NF-κB转录因子相关的信号通路机理被解析和发现，简而概之，归纳为经典的NF-κB激活信号通路和非经典的NF-κB激活信号通路。

经典的NF-κB激活信号通路通过Toll-like受体（TLRs），IL-1受体，TNF受体和BCR/TCR受体来调节。一般来说刺激因子包括肿瘤坏死因子α（TNFα），脂多糖(LPS内毒素，革兰氏阴性细胞的细胞壁)，白介素-1β（IL-1β）和多种来源的抗原等。非经典的NF-κB激活信号通路通过不同起源的受体包括B细胞激活因子受体（BAFFR），淋巴毒性β受体(LTβR)，CD40, RANK, TNFR2，Fn14等来调节。刺激因子包括BAFF, LIGHT，RANKL，TNFSF12等。刺激因子通过在细胞外结合对应的受体激活胞内下游的信号通路激活NF-κB因子调节细胞功能。NF-κB信号通路的激活最终会使得细胞长时间存活，增殖，细胞因子释放，B细胞成熟，Th细胞分化，免疫细胞调节等复杂多样的生理功能。

        NF-κB信号通路在机体免疫外界感染和自身免疫，免疫监视肿瘤和促进肿瘤的发生等方面扮演着多面的角色，其复杂的配体受体激活路径使得其在药物研发过程中，针对此信号通路的生物功能学实验可靠性较差，需要更为严格的控制条件进行单一变量（药物浓度）实现功能学评价测定的目的。其中候选药物或者测定试剂中有极大的可能引入内毒素（LPS），使得实验结果失真，产生误导性。

实验案例分析

        CD40是极具潜力的抗肿瘤和自身免疫性疾病的靶点，Novartis 的iscalimab，Astrazeneca的MEDI5083，ABBVIE的ABBV-323/ABBV-927，Roche的Selicrelumab等均在针对此靶点进行临床阶段的抗体药物开发，Gang Li etc.报道过利用CD40的信号通路进行高通量筛选小分子化合物的案例，案例中介绍了利用其稳转高表达CD40的BL2-NFkB-luc细胞株，CD40L刺激，通过候选药物是否阻断luciferase表达来测定活性的案例；在此案例中也添加了一组阳性对照，即TLR4质粒瞬转高表达CD40的BL2-NFkB-luc细胞株使TLR4同时高丰度表达，LPS（内毒素）刺激，发现能够阻断CD40L刺激BL2-NFkB-luc的luciferase表达的候选药物也能阻断LPS刺激的TLR4-BL2-NFkB-luc的luciferase表达，可见CD40和TLR4共享NF-κB信号通路，内毒素的存在可能会极大的干扰检测方法的可信度。

        在与免疫细胞有关的实验中，Hui Xu etc. 等报道LPS（内毒素）通过刺激B细胞从而介导T细胞的分化，在存在抗原多肽的情况下不同剂量的内毒素会刺激有B细胞共培养T细胞的细胞因子IL-4,IFN-γ, IL-10的释放，其中IFN-γ的释放是剂量依赖的，和对照组相比，低至0.1ng/ml的内毒素都会引起IFN-γ的显著性释放；IL-10在内毒素在0.1ng/ml-1ng/ml的浓度范围内无显著的释放，在内毒素为10ng/ml-10000ng/ml时显著的释放；IL-4在内毒素在0.1ng/ml-100ng/ml的浓度范围内有显著的释放，在内毒素为1000ng/ml-10000ng/ml时无显著的释放。由此可见不同剂量的LPS刺激免疫细胞释放细胞因子的趋势并不是一致，内毒素的存在会极大的干扰对免疫细胞学实验结果的解读

内毒素单位转换：

一般来说会采用EU（Endotoxin Unit）来测定内毒素的活性，现在市面上测定内毒素的方法很多如鲎试验定量测定法或者LAL测定法等。一般来说采用活性单位（EU）比使用质量单位更具备可比性，根据内毒素来源的菌种不同，一般来说1ng=2-50EU。在上述的案例中0.1ng/ml的内毒素就可能引起免疫细胞的活性反应，按照最大比例换算，转换成EU即0.2EU/ml。如果在细胞学反应中加入的抗体或者配体蛋白的浓度为10ug/ml，如果要排除内毒素对免疫学实验的干扰，加入的抗体或者配体蛋白的内毒素浓度需要控制在<20EU/mg。

      一般来讲，现在市面上提供的蛋白产品的内毒均控制在<1000EU/mg,远远不能满足免疫细胞功能学评价方法的需求，恺佧生物提供低内毒系列靶点蛋白的定制服务，助力免疫细胞功能学实验。

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